支原體(Mycoplasma)是細(xì)胞培養(yǎng)中常見的污染物，其污染可導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)失真、細(xì)胞功能異常甚至實(shí)驗(yàn)失敗。支原體DNA檢測(cè)試劑盒通過特異性識(shí)別支原體DNA序列，結(jié)合熒光標(biāo)記或核酸擴(kuò)增技術(shù)，實(shí)現(xiàn)對(duì)支原體污染的快速、靈敏檢測(cè)。以下從技術(shù)原理、核心組分及操作流程三方面展開分析。
一、技術(shù)原理：基于DNA特征與分子生物學(xué)技術(shù)
支原體DNA檢測(cè)試劑盒的核心原理是靶向支原體特異性DNA序列，主要依賴以下兩種技術(shù)路徑：
熒光染色法（Hoechst 33258探針法）?
該方法利用熒光染料Hoechst 33258與支原體DNA的A-T富集區(qū)域特異性結(jié)合。支原體基因組中A-T含量高達(dá)55%~80%，遠(yuǎn)高于真核生物(約50%)，因此染料可優(yōu)先結(jié)合支原體DNA，形成熒光標(biāo)記的復(fù)合物。染色后，通過熒光顯微鏡觀察細(xì)胞周圍是否出現(xiàn)藍(lán)色熒光小點(diǎn)(支原體DNA聚集區(qū))，即可判斷污染情況。此方法操作簡(jiǎn)便，但靈敏度較低(檢測(cè)限約10^3 CFU/mL)，需結(jié)合細(xì)胞培養(yǎng)觀察。
qPCR熒光探針法?
基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)，試劑盒設(shè)計(jì)針對(duì)支原體16S rRNA基因保守區(qū)的特異性引物和熒光探針(如FAM標(biāo)記)。通過擴(kuò)增支原體DNA的靶序列，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)強(qiáng)度變化。當(dāng)擴(kuò)增產(chǎn)物達(dá)到閾值時(shí)，Ct值(循環(huán)閾值)與支原體DNA初始濃度呈負(fù)相關(guān)，從而實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)。此方法靈敏度可達(dá)10^1 CFU/mL，且能區(qū)分支原體與其他微生物(如細(xì)菌、真菌)，但需依賴專業(yè)設(shè)備及標(biāo)準(zhǔn)化操作流程。
二、核心組分與功能
支原體DNA檢測(cè)試劑盒通常包含以下關(guān)鍵組分：
核酸提取模塊?
裂解液：破壞細(xì)胞膜/壁，釋放DNA(如含Triton X-100、SDS的緩沖液)。
純化柱或磁珠：去除蛋白質(zhì)、多糖等雜質(zhì)，富集支原體DNA。
擴(kuò)增反應(yīng)體系?
引物/探針混合物：特異性靶向支原體DNA(如Mycoplasma genitalium的16S rRNA基因)。
qPCR預(yù)混液：含Taq酶、dNTPs、緩沖液等，支持高溫變性、退火、延伸循環(huán)。
內(nèi)控模板：用于監(jiān)控實(shí)驗(yàn)操作有效性，避免假陰性結(jié)果。
輔助試劑?
固定液(如甲醇/乙酸混合液)：用于細(xì)胞樣本固定，保持DNA結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。
封片液/封固液：防止熒光淬滅，延長(zhǎng)樣本保存時(shí)間。
三、應(yīng)用前景
隨著合成生物學(xué)與微流控技術(shù)的發(fā)展，支原體檢測(cè)正朝著便攜化與自動(dòng)化方向演進(jìn)。例如，等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(如LAMP)結(jié)合側(cè)向?qū)游鲈嚰?，可?shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)；納米孔測(cè)序技術(shù)則能同時(shí)鑒定支原體種類與耐藥基因。未來，試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)化與成本控制將是推動(dòng)其在工業(yè)與臨床廣泛使用的關(guān)鍵。
支原體DNA檢測(cè)試劑盒通過靶向核酸特征與分子擴(kuò)增技術(shù)，為科研與生產(chǎn)提供了可靠的支原體污染防控手段。其技術(shù)迭代將持續(xù)提升檢測(cè)精度與效率，成為生物醫(yī)藥領(lǐng)域的常見質(zhì)量控制工具。
