熒光定量PCR(qPCR)儀是分子生物學研究、臨床診斷(如新冠病毒檢測)等領(lǐng)域的核心設備，其準確性直接影響實驗結(jié)果的可靠性。校正(校準)是確保qPCR儀性能穩(wěn)定的關(guān)鍵步驟，需定期對溫控系統(tǒng)(溫度控制精度)和光學系統(tǒng)(熒光信號檢測)進行系統(tǒng)性驗證與調(diào)整。
一、校正的核心目標
qPCR儀的校正旨在確保以下關(guān)鍵性能指標符合要求：
溫控系統(tǒng)：溫度示值誤差(設定溫度與實際溫度的偏差)、溫度均勻度(反應孔間溫差)、溫度波動度(溫度隨時間的變化)、溫度最大過沖量(升溫/降溫過程中超出設定值的幅度)、平均升降溫速率(升溫/降溫的速度)。
光學系統(tǒng)：熒光強度精密度(同一孔熒光信號的一致性)、閾值循環(huán)數(shù)(Ct值)精密度(不同孔Ct值的一致性)、熔解溫度(Tm值)漂移(熒光強度下降一半時的溫度偏差)、熒光線性相關(guān)系數(shù)(熒光強度與核酸濃度的線性關(guān)系)。
二、校正前的準備工作
1. 環(huán)境條件
溫度：15–30℃(避免溫度波動影響校準結(jié)果)；
相對濕度：20–85%RH(防止儀器受潮)；
電源：穩(wěn)定電壓(建議使用UPS)，避免斷電影響校準進程。
2. 設備與材料
標準物質(zhì)：需使用有證標準物質(zhì)(如質(zhì)粒DNA、核糖核酸標準物質(zhì))，其特性量值(拷貝數(shù)≥10? copies/μL)及相對擴展不確定度(≤5%)需符合JJF(津)04-2020要求；
校準設備：光學模擬器(集成溫度傳感器與發(fā)射光發(fā)生器，溫度測量范圍0–120℃，最大允許誤差±0.1℃；發(fā)射光波長360–780nm，相對光輻射強度可調(diào))、多通道溫度校驗儀(如JDPC-96，用于測量反應孔間溫差)；
耗材：專用校準板(如AB7500 ROI校準板、背景校準板)、移液器(2μL、10μL等，需計量檢定合格)、無粉手套(防止污染校準板)。
三、校正的主要流程
qPCR儀的校正流程需嚴格遵循JJF(津)04-2020《實時熒光定量PCR儀校準規(guī)范》，主要包括溫度系統(tǒng)校準與光學系統(tǒng)校準兩部分，以下以AB7500系列儀器為例說明具體步驟：
?。ㄒ唬囟认到y(tǒng)校準
溫度是qPCR反應的核心參數(shù)，直接影響DNA擴增效率。溫度系統(tǒng)校準需使用光學模擬器(替代反應管)，模擬實際反應中的溫度變化，驗證儀器的溫度控制性能。
1. 校準前準備
將光學模擬器與qPCR儀連接，確保下方溫度傳感器與上方熒光發(fā)射光源與儀器均熱塊接觸良好；
在光學模擬器下涂抹導熱油，增強熱傳導；
打開儀器軟件，選擇“校準”模塊，進入“溫度校準”程序。
2. 校準程序
預熱：設定儀器溫度為23℃，運行預熱程序(約10分鐘)，使儀器達到穩(wěn)定狀態(tài)；
溫度點設置：選擇9個溫度點(30℃、50℃、60℃、70℃、90℃、95℃等)，每個溫度點持續(xù)2分鐘(用于測量溫度示值誤差、均勻度、波動度)；
升溫/降溫過程：從50℃升溫至90℃(測量平均升溫速率)，再從90℃降溫至50℃(測量平均降溫速率)；
數(shù)據(jù)采集：儀器自動記錄每個溫度點的設定溫度(Ts)、實際溫度平均值(T?)、溫度波動值(T_v)、最大過沖值(T_os)。
3. 結(jié)果計算
溫度示值誤差：△T = Ts - T?(要求≤±0.5℃)；
溫度均勻度：△Tu = T_umax - T_umin(T_umax為所有孔溫度最大值，T_umin為最小值，要求≤1.0℃)；
溫度波動度：△T_v = ±(T_max - T_min)/2(T_max為單個孔溫度最大值，T_min為最小值，要求≤0.2℃)；
溫度最大過沖量：△T_os = Tosmax - Ts(Tosmax為所有孔過沖值最大值，要求≤3.0℃)；
平均升溫速率：v_up = (TB - TA)/tut(TB為90℃溫度點平均值，TA為50℃溫度點平均值，tut為升溫時間，要求≥4℃/秒)；
平均降溫速率：v_down = (TB - TA)/tdo(tdo為降溫時間，要求≥3℃/秒)。
（二）光學系統(tǒng)校準
光學系統(tǒng)負責檢測熒光信號，其準確性直接影響Ct值與核酸濃度的定量結(jié)果。光學系統(tǒng)校準需使用專用校準板(如AB7500 ROI校準板)，調(diào)整熒光檢測器的靈敏度與信號一致性。
1. 背景校準
目的：消除儀器本底熒光(如電子信號、塑料耗材污染)的干擾；
步驟：
(1)取出背景校準板(需室溫放置5分鐘，避免冷凝水)；
(2)將校準板裝入儀器，運行“背景校準”程序(約30分鐘)；
(3)軟件自動記錄背景熒光信號，生成背景校正文件(后續(xù)實驗中自動扣除)。
2. ROI（感興趣區(qū)域）校準
目的：將反應板上的孔位映射到儀器檢測器，確保每個孔的熒光信號準確采集；
步驟：
(1)取出ROI校準板(標準板或快速板，需渦旋5秒并離心2分鐘)；
(2)將校準板裝入儀器，運行“ROI校準”程序；
(3)軟件自動拍攝每個濾光片的圖像，生成ROI掩碼(每個孔周圍顯示綠色圓圈，表明校準成功)；
(4)若圖像過飽和(孔內(nèi)熒光過強)，需調(diào)整曝光時間(如從2048減少至1024)，重新采集圖像。
3. 光學校準
目的：補償光學系統(tǒng)的物理效應(如濾光片的光譜響應)，確保熒光信號的準確性；
步驟：
(1)選擇“光學校準”程序，加載ROI校準文件；
(2)運行程序(約10分鐘)，軟件自動分析熒光信號的光譜特征，生成光學校正文件。
4. 染料校準
目的：驗證不同染料(如FAM、VIC、ROX)的熒光信號準確性，確保多染料實驗的可靠性；
步驟：
(1)取出染料校準板(包含多種熒光染料，如CY3、CY5、FAM等)；
(2)將校準板裝入儀器，運行“染料校準”程序；
(3)軟件自動采集每個染料的熒光光譜，生成染料校正文件(后續(xù)實驗中自動識別染料信號)。
?。ㄈ┙Y(jié)果記錄與證書
校準完成后，需出具CNAS認證的校準證書，包含以下內(nèi)容：
(1)儀器基本信息(型號、序列號、生產(chǎn)廠家)；
(2)校準環(huán)境條件(溫度、濕度、時間)；
(3)校準結(jié)果(溫度示值誤差、均勻度、光學系統(tǒng)精密度等)；
(4)校準人員與審核人員簽名；
(5)校準機構(gòu)資質(zhì)(CNAS認可編號)。
四、校正的注意事項
1. 校準周期
建議每12個月進行一次全面校準(符合JJF(津)04-2020要求)；
高使用頻率(如每天運行10次以上)或關(guān)鍵應用(如臨床診斷)下，可縮短至6個月一次；
儀器搬遷、維修或更換關(guān)鍵部件(如加熱塊、檢測器)后，需重新校準。
2. 專業(yè)支持
校準需由廠家工程師或具備資質(zhì)的第三方機構(gòu)(如天津市計量監(jiān)督檢測科學研究院)執(zhí)行，確保符合SOP(標準操作程序)；
禁止非專業(yè)人員自行調(diào)整儀器參數(shù)(如溫度設置、光學濾光片)，以免影響校準結(jié)果。
3. 校準后的驗證
校準完成后，需運行標準物質(zhì)驗證實驗(如質(zhì)粒DNA標準物質(zhì))，檢測Ct值的重復性(變異系數(shù)≤3%)與線性相關(guān)系數(shù)(R²≥0.99)，確保校準效果；
若驗證結(jié)果不符合要求，需重新校準或聯(lián)系廠家維修。
五、常見問題與解決
1. 溫度均勻度不符合要求
原因：均熱塊污染(如殘留的PCR產(chǎn)物)、溫度傳感器老化；
解決：清潔均熱塊(用無水乙醇擦拭)，更換溫度傳感器。
2. 熒光信號強度低
原因：ROI校準失敗(孔位映射錯誤)、背景熒光過高；
解決：重新進行ROI校準，運行背景校準(更換背景校準板)。
3. Ct值變異大
原因：溫度波動度超標(如加熱塊不穩(wěn)定)、熒光檢測器靈敏度下降；
解決：檢查加熱塊的溫度穩(wěn)定性(用多通道溫度校驗儀測量)，更換熒光檢測器。
六、總結(jié)
熒光定量PCR儀的校正是確保實驗數(shù)據(jù)準確可靠的關(guān)鍵步驟，需嚴格遵循行業(yè)標準(如JJF1527-2015、JJF(津)04-2020)，定期對溫控系統(tǒng)與光學系統(tǒng)進行校準。校準過程中需注意環(huán)境條件、專業(yè)支持與結(jié)果驗證，確保儀器的性能符合實驗要求。通過規(guī)范的校正流程，可有效減少實驗誤差，提高qPCR結(jié)果的準確性與重復性。
